别称IPS Cells, multifunctional induced stem cells货号Delf-16787 规格 1×10⁶/T25培养瓶 传代比例1:2传代用途仅供科研使用

细胞名称：DYR0100

细胞描述：将人包皮细胞诱导成 iPS 细胞，通过重编程转录因子为：OCT4、SOX2、KLF4、

MYC 诱导建立 iPS 细胞，培养时无需饲养层细胞。

形态：球形克隆

来源性别：男性疾病：健康

年龄：新生儿

细胞来源：从 ATCC 引进（/）

ATCC number: ACS-1011TM

冻存日期/代数：详见 冻存管/培养瓶 标识建议复苏培养体系：1 个 T25 培养瓶

细胞状态：良好

支原体检测结果：阴性

细胞用途：仅供科研使用。

iPS细胞培养基培养人胚胎干细胞

1.试剂和材料

iPS细胞培养基试剂盒

所需的其它试剂和材料

2.培养流程

2.1试剂的制备

2.1.1 培养基制备

2.1.1在室温（15-25℃）或冰箱内（2-8℃）过夜解冻细胞培养基添加剂，可在无菌条件下将添加剂分装为适量的工作等份，并在-20℃下冻存。冷冻的分量须在3个月内用完。解冻后的分量应该一天内制备成培养基。请勿在解冻后再次冷冻。

2.1.2.在无菌条件下将20mL的添加剂全部解冻后加入到500mL的基础培养基中，充分混匀。培养基在（2-8℃）下储存时刻维持稳定状态最多2-3周，或在-20℃下冷冻时刻维持稳定状态最多3个月。在室温（15-25℃）或冰箱内（2-8℃）过夜解冻冷冻的培养基，不要长时间放在37℃水浴内加热培养基。

如果在无菌条件下制备，细胞培养基可直接使用。

2.1.2 Matrigel工作液的配制与包被

鉴于基质胶的操作环境要求比较严格，为保证您的实验顺利，特此对以下几个方面进行温馨提示：

1. 收货时，首先确认还有干冰，Matrigel成固态，液面水平，如有异常请及时拍照取证并联系我们。

2. 整个Matrigel只能分装一次，在分装前，要先放4℃冰箱（先把Matrigel插在冰上，然后放入4℃冰箱）过夜，且分装用的枪头、EP管等都要提前-20℃预冷（基质胶在10℃以上会发成胶凝固导致基质胶报废），整个分装过程都需在冰上进行，且以后每次试验时拿出本次用量所需的基质胶。

3. 实验人员手心不要接触基质胶，如：要手持装有Matrigel的EP管的上方，防止体温使基质胶成胶凝固。 

4. Matrigel的稀释比例建议为100倍稀释。

本库建议的配制Matrigel工作液方法：

1. 稀释前将Matrigel放入4℃冰箱过夜融化。

2. 将适量体积的稀释液（DMEM/F12或PBS）置4℃冰箱预冷。

3. 将融化的Matrigel与稀释液从冰箱中取出并打开盖子，用移液管吹吸稀释液几次以冷却移液管，并吸取少量稀释液加入Matrigel管中混匀，将Matrigel转移到稀释液中，并吹打混匀。（因为Matrigel遇15℃以上温度就会成凝胶粘在原装玻璃壁和移液管壁上，故Matrigel从冰箱拿出来以后尽快打开盖子并转移到预冷的稀释液中，吸取Matrigel的移液管一定要冷却）。

4. 立即用稀释后的Matrigel包被培养板或培养皿。对于6孔板，每个孔使用1mL稀释后的Matrigel，对于6cm的培养皿，每个孔使用2mL稀释后的Matrigel，晃动培养板使Matrigel溶液均匀的分布在表面上。

5. 使用前，包被的培养板应放在培养箱（37℃）下至少1h。请勿让培养板脱水。在培养板可供使用之前，请勿移除Matrigel溶液。

如果不立即使用，培养板必须密封，以防止脱水。包被后的培养板可在2-8℃下最多储存7天。

如果Matrigel溶液并未覆盖表面，则无法实验的细胞培养，因此，不建议使用含有溶液已蒸发区域的培养板。

如果已将培养板在2-8℃下储存，则在移除Matrigel溶液之前，将培养板在培养箱（37℃）下放置30min。

2.1.3 Y27632的配制

Y27632粉末溶解在PBS中，配制成浓度未10mM的储存液，0.22μm滤膜过滤除菌。分装后冷冻于-20℃。

Y27632提高复苏和传代后的克隆形成率，所以只在复苏和传代步骤添加（1:1000，即终浓度为10μM），换液时不添加。

2.2.复苏

在开始复苏前，将所有试管、预热后的培养基和培养皿准备好，已确保尽快完成复苏过程。

1. 将冻存管从液氮中取出，快速在37℃水浴槽中解冻，轻柔持续地摇动冻存管，直到只剩下一个小冷冻团。从水浴槽取出冻存管，70%乙醇擦拭进行消毒。

2. 使用移液管将冻存管中含有iPS细胞的冻存液轻轻转移至一个含有5-6mL已经预热的培养基的15mL离心管中，过程必须轻柔防止吹散细胞团。

3. 室温300g离心5min。

4. 吸出培养基，确保细胞团完整。

5. 然后缓慢加入1mL培养基，用手指轻弹离心管底部，使细胞团脱离底部并分散。

6. 轻轻的将此1mL细胞悬液转移至已包被的培养皿/板/瓶，根据最终培养细胞的液体体积，加入ROCK inhibitor Y27632，终浓度为10μM。

7. 将培养皿/板/瓶置于37℃培养箱中，每天更换培养基（换液不需要再添加Y27632，但培养基需提前预热）。

2.3.传代

当集落变得较大、中心变得密集、明亮（对比边缘），相邻的集落开始融合时，此时可进行传代。

1. 传代前，准备 37 ℃预热好的无钙镁PBS 溶液及消化液，培养基。

2. 吸走上清，并加入37℃预热好的PBS 溶液清洗1次。

3. 加入适量（按 6 孔板每孔加 1mL，6cm 皿加 2mL，10cm 皿加 3mL 的量）的 37℃预热好的消化液。

4. 37℃放置1-2min，用手指轻弹皿/板/瓶身，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离培养皿/板底，克隆内部大部分细胞成团脱落。

5. 加入适量的培养基终止消化。

6. 移入离心管，300g离心5min。

7. 离心后重悬（重悬步骤参照复苏4-5步）。

8. 传代比例为 1：6—1：8，根据最终培养细胞的液体体积，加入ROCK inhibitor Y27632，终浓度为10μM。

9. 将培养皿/板/瓶置于37℃培养箱中，每天更换培养基（换液不需要再添加Y27632，但培养基需提前预热）。

2.4.冻存

当集落变得较大、中心变得密集、明亮（对比边缘），相邻的集落开始融合时，此时可进行传代。

1. 传代前，准备37 ℃预热好的无钙镁 PBS 溶液及消化液，培养基。

2. 吸走上清，并加入37℃预热好的 PBS 溶液清洗1次。

3. 加入适量（按 6 孔板每孔加 1mL，6cm 皿加 2mL，10cm 皿加 3mL 的量）的 37℃预热好的消化液。

4. 37℃放置1-2min，用手指轻弹皿/板/瓶身，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离培养皿/板底，克隆内部大部分细胞成团脱落。

5. 加入适量的培养基终止消化。

6. 移入离心管，300g离心5min。

7. 离心后重悬（重悬步骤参照复苏4-5步）。

8. 使用预冷的冻存液轻轻的重悬细胞团，然后将细胞悬液转移至冻存管，冻存按 6 孔板每孔冻 1 支，6cm 皿冻 2-4 支，10cm 皿冻 6-12 支。

我们主要的产品有：病理学检测服务，细胞与蛋白，分子生物学检测，动物实验造模，科研细胞及相关周边配套产品与服务。

细胞产品：包含细胞系、原代细胞、永生化细胞（支持定制），Luc示踪细胞、IPS细胞、耐药株、细胞代购服务。

病理服务：包含普通病理（包埋，切片，染色）、分子病理（组化、免疫荧光、TUNEL、原味杂交）、病理图像（切片扫描、单标多标、共聚焦、三维重建）、超微病理（透射电镜、扫描电镜、免疫电镜服务）。

培养基产品：包含基础培养基如DMEM、DMEM/F12、1640、MEM、EMEM、F12、F12K、L15、DMEM低碳、1640低碳，无酚红定制产品等基础培养基供应。

细胞系专用培养基：涵盖我库所有细胞系对应的专用培养基（含血清，因子，双抗等），价格实惠。

原代细胞专用培养基包括：

DELF原代上皮细胞专用培养基（EpiCM）

DELF原代成纤维细胞专用培养基（FM）

DELF原代内皮细胞专用培养基（ECM）

IPS人诱导多能干细胞专用培养基

DELF原代神经元细胞专用培养基

DELF原代少突胶质细胞专用培养基

DELF原代星形胶质细胞专用培养基

DELF原代肝实质细胞专用培养基

DELF原代星状细胞专用培养基

DELF原代角质形成细胞专用培养基

DELF原代巨噬细胞专用培养基

DELF原代间充质干细胞专用培养基

DELF原代内皮祖细胞专用培养基

DELF原代神经干细胞专用培养基

DELF原代周细胞专用培养基

DELF原代雪旺细胞专用培养基

DELF原代黑色素细胞专用培养基

DELF原代骨骼肌细胞专用培养基

DELF原代成骨细胞专用培养基

DELF原代软骨细胞专用培养基

DELF原代肾系膜细胞专用培养基

DELF原代心肌细胞专用培养基

DELF原代前脂肪细胞专用培养基

DELF原代间充质干细胞无血清专用培养基

DELF原代平滑肌细胞专用培养基

DELF原代平滑肌细胞低血清专用培养基

DELF原代肿瘤细胞专用培养基

DELF原代间质细胞专用培养基

DELF原代T淋巴细胞专用培养基

DELF原代卵巢颗粒细胞专用培养基

DELF原代肥大细胞专用培养基

DELF原代破骨细胞专用培养基

DELF原代NK细胞专用培养基

DELF原代内膜细胞专用培养基

DELF原代B淋巴细胞专用培养基

DELF原代精原细胞专用培养基

DELF原代树突状（DC）细胞专用培养基

DELF原代肝卵圆细胞专用培养基

DELF原代肾足细胞专用培养基

DELF原代基底细胞专用培养基

DELF原代基质细胞专用培养基

DELF原代CIK细胞专用培养基

DELF原代淋巴细胞专用培养基

DELF原代肌腱细胞专用培养基

DELF原代卵泡膜细胞专用培养基

DELF原代支持细胞专用培养基

DELF原代髓核细胞专用培养基

DELF原代脂肪细胞专用培养基

DELF原代绒毛膜滋养层细胞专用培养基

请注意：

所有500ml专用培养基采用分装形式发货，其中细胞因子，双抗，血清采用干冰发货，基础培养基采用冰袋发货。收到货后根据业务经理提示的配置方式进行配置，各成分按照存储温度分开存储。

1）细胞冻存复苏操作

取装有1 mL 细胞悬液的冻存管，置于 37 ℃水浴中快速振荡至完全解冻；将细胞悬液移入装有 4~6 mL 完全培养基的离心管，充分混匀。 1000 RPM 离心 3~5 min，弃除上清，加入新鲜完全培养基重悬细胞。把细胞悬液接种至培养瓶（培养皿），补加 6~8 mL 完全培养基，于 37 ℃恒温培养箱静置培养过夜。次日在显微镜下观察细胞状态与汇合密度。

2）细胞传代培养

当细胞汇合度达到 80%~90% 时即可进行传代操作。 本细胞贴壁性能弱，属于半贴壁 + 半悬浮混合生长型细胞，传代操作步骤如下：

1. 细胞收集 先把培养瓶内悬浮细胞全部转移至离心管；采用无钙镁 PBS 洗涤贴壁细胞 1~2 次。该细胞贴壁不牢固，洗涤过程中贴壁细胞会随 PBS 脱落，因此洗涤液同样收集至离心管内。

2. 胰酶消化 向培养瓶内加入 0.25%(w/v) 胰蛋白酶 - 0.53 mM EDTA 消化液（T25 培养瓶加 1~2 mL，T75 培养瓶加 2~3 mL），放入 37 ℃培养箱消化 1~2 min；若细胞较难消化，可适度延长消化时长。显微镜下观察，待绝大多数细胞回缩变圆、开始脱壁后迅速取出培养瓶，轻敲瓶壁，随即加入 3~4 mL 含 10% 胎牛血清的培养基终止胰酶消化。

3. 离心分瓶接种 将悬浮细胞、PBS 洗涤细胞与胰酶消化收获的所有细胞合并，1000 rpm 离心 5 min，弃上清。加入 1~2 mL 新鲜培养基充分重悬，按照 1:2 的比例分装至新 T25 培养瓶，每瓶补加 6~8 mL 新鲜配制的完全培养基，维持细胞活性。后续传代可依据细胞生长速率，调整分装比例为 1:2 ~ 1:5。

3）细胞冻存保种

建议在细胞到货后的前 3 代完成种子细胞冻存，留存保种库，保障后续实验供给。 以 T25 培养瓶为例，操作流程如下：

1.参照细胞传代流程完成细胞消化与收集，使用血球计数板测定活细胞浓度。推荐冻存终密度：(1×106 至1×107) 个活细胞 /mL。

2.1000 rpm 离心 3~5 min，充分弃除上清液；用预先配制好的冻存液重悬细胞，调整浓度至目标密度，分装至细胞冻存管。在冻存管外壁清晰标注细胞名称、细胞代数、冻存日期等关键信息。

3.将冻存管放入程序降温盒，置于 - 80 ℃冰箱梯度降温过夜；次日转移至液氮罐中长期保存，同步登记冻存位置编号，方便后续调取。

悬浮细胞传代方法

1.当细胞密度达到8-10×105cell/ml 时，进行传代处理。

2.在生物安全柜无菌环境下打开培养瓶，将瓶内全部细胞悬液移入离心管。

3.1000 rpm 离心 5 min，离心结束后弃除上清培养液。

4.准备 2 支全新 T-25 培养瓶。向细胞沉淀中加入完全培养基充分重悬，把细胞浓度调整至 2-4×105cell/ml，均分接种至两个培养瓶内，每瓶补加培养基至 6～8 mL。

5.水平平放培养瓶，轻轻摇匀细胞悬液，放入 37 ℃、5% CO?恒温培养箱静置培养。

仅用于科研，不用于临床