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B6-BLU 小鼠胚胎干细胞
产品简介
| 品牌 | DELF |
|---|
| 一、细胞简介 | |
| 细胞描述 | 该细胞系被报道具有生殖能力，源自一个携带LacZ报告基因的C57BL/6转基因小鼠。这段转基因在pUC19中组装，包含1.9 kb人54 HS-2片段（两侧KpnI/PvuII酶切位点），位于标记的ß-珠蛋白转基因上游。培养时需使用昆明白MEF（SCSP-101R）作为饲养层细胞。 |
| 细胞名称 | B6-BLU 小鼠胚胎干细胞 |
| 细胞别称 | B6-BLU |
| 细胞货号 | Delf-27175 |
| 来源 | 小鼠，57BL/6Tac品系 内细胞团 |
| 细胞形态 | 球形克隆 |
| 生长特性 | 贴壁细胞 |
| 培养条件 | 准备DMEM 基础培养基（81.5%） 优质胎牛血清（15%） GlutaMAX-1（1%） MEM NEAA非必需氨基酸（1%） P/S-（1%） β-巯基乙醇（1.25 mL） LIF（10ng/mL） 注意： 1、建议使用KM- MEF作为饲养层细胞。 2、在铺胚胎干细胞前，需对MEF进行处理，具体处理步骤见下文灭活MEF。 3、该细胞建议冻存干冰发货，不适合长时间活细胞运输，会影响细胞活力。 |
| 培养环境 | 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。 |
| 二、细胞复苏方法 | |
| 复苏步骤 | 1. 将小鼠胚胎干细胞冻存管从液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用 75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 2. 将冻存管内细胞悬液转移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干细胞培养液的 15ml 离心管内，以 1000 rpm，离心 5 min。 3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞培养液 2 ml，吹打悬浮。 4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。 5. 转移至 1 个已经铺好 MEF 细胞的 T25 培养瓶中培养。 6. 每天更换小鼠胚胎干细胞培养液。 |
| 三、细胞传代方法 | |
| 传代比例 | 1:4-1:7 |
| 传代方法 | 1. 一般在复苏后第 2-3 天传代，视克隆大小和密度而定 2. 吸除废液。 3. 用 PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。 4. 加入 1.0 ml 的 0.25%（含 EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使覆盖底面，置于 37℃培养箱内消化细胞。 5. 在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要 1-2 min）。 6. 加 2 ml 小鼠胚胎干细胞培养液终止消化。 7. 以 1000 rpm，离心 5 min，弃上清。 8. 加入约 1 ml 小鼠胚胎干细胞培养液，多次轻轻吹打细胞， 制成单细胞悬液。 9. 加入足量的小鼠胚胎干细胞培养液，吹打混匀，细胞悬液分装到铺好 MEF 细胞的 T25 培养瓶中。一般地，一个 T25 培养瓶加入 5-6 ml 培养液。放入 37℃培养箱内培养。每天换液。 |
| 注意事项 | 不同品牌消化时间差别较大，可根据细胞形态判断消化进程 |
| 四、细胞冻存方法 | |
| 冻存液配方 | 培养液 60%，FBS 30%，DMSO 10%现用现配。 我库冻存时，体积为 500 μl，预期存活率 70%，每支冻存管的细胞复苏，3 至4 天后，会形成 30 至 40 个克隆，建议复苏至 1 个 T25 培养瓶中。 |
| 冻存规格 | 按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。 |
| 冻存方法 | 1. 按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。 2. 以 1000 rpm，离心 5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。 3. 按每支存管内加入 500 ml 细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。 4．将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。 |
| 五、注意事项 | |
| 注意事项 | 1、所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。 2、建议在复苏冻存细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩。注意：冻存管浸没在液氮中会泄漏，并会慢慢充满液氮。解冻时，液氮转化成气相可能导致容器爆炸或用危险力吹掉其盖子，从而产生飞扬的碎屑造成人员伤害。 3、本产品于科学研究，绝不可作为动物或人类疾病的治疗产品使用。 |
| 附： | 小鼠胚胎干细胞与 MEF 细胞分离的简易方法（差速贴壁法）： 1.培养中的小鼠胚胎干细胞，按传代的操作方法将细胞用消化并吹打成单细胞悬液后，加入适量的提前温育好的小鼠胚胎干细胞培养液重悬细胞， 吹打混匀，细胞悬液分装到无 MEF 细胞的培养皿或培养瓶（一般地，一个T25 培养瓶中培养的小鼠胚胎干细胞，在一个 10 cm 培养皿中进行差速贴壁。不要事先铺明胶，如铺明胶则细胞贴壁速度过快无法有效分离小鼠胚胎干细胞与 MEF 细胞）中。 2. 培养皿或培养瓶置于 37°C 培养箱内静置 1 小时。 3. 1 小时后，绝大部分 MEF 细胞已贴在培养皿或培养瓶底面，而大部分小鼠胚胎干细胞仍然悬浮在培养液中。收取培养液，进行后续实验。 |
我们主要的产品有：病理学检测服务，细胞与蛋白，分子生物学检测，动物实验造模，科研细胞及相关周边配套产品与服务。
细胞产品：包含细胞系、原代细胞、永生化细胞（支持定制），Luc示踪细胞、IPS细胞、耐药株、细胞代购服务。
病理服务：包含普通病理（包埋，切片，染色）、分子病理（组化、免疫荧光、TUNEL、原味杂交）、病理图像（切片扫描、单标多标、共聚焦、三维重建）、超微病理（透射电镜、扫描电镜、免疫电镜服务）。
培养基产品：包含基础培养基如DMEM、DMEM/F12、1640、MEM、EMEM、F12、F12K、L15、DMEM低碳、1640低碳，无酚红定制产品等基础培养基供应。
细胞系专用培养基：涵盖我库所有细胞系对应的专用培养基（含血清，因子，双抗等），价格实惠。
原代细胞专用培养基包括：
DELF原代上皮细胞专用培养基（EpiCM）
DELF原代成纤维细胞专用培养基（FM）
DELF原代内皮细胞专用培养基（ECM）
IPS人诱导多能干细胞专用培养基
DELF原代神经元细胞专用培养基
DELF原代少突胶质细胞专用培养基
DELF原代星形胶质细胞专用培养基
DELF原代肝实质细胞专用培养基
DELF原代星状细胞专用培养基
DELF原代角质形成细胞专用培养基
DELF原代巨噬细胞专用培养基
DELF原代间充质干细胞专用培养基
DELF原代内皮祖细胞专用培养基
DELF原代神经干细胞专用培养基
DELF原代周细胞专用培养基
DELF原代雪旺细胞专用培养基
DELF原代黑色素细胞专用培养基
DELF原代骨骼肌细胞专用培养基
DELF原代成骨细胞专用培养基
DELF原代软骨细胞专用培养基
DELF原代肾系膜细胞专用培养基
DELF原代心肌细胞专用培养基
DELF原代前脂肪细胞专用培养基
DELF原代间充质干细胞无血清专用培养基
DELF原代平滑肌细胞专用培养基
DELF原代平滑肌细胞低血清专用培养基
DELF原代肿瘤细胞专用培养基
DELF原代间质细胞专用培养基
DELF原代T淋巴细胞专用培养基
DELF原代卵巢颗粒细胞专用培养基
DELF原代肥大细胞专用培养基
DELF原代破骨细胞专用培养基
DELF原代NK细胞专用培养基
DELF原代内膜细胞专用培养基
DELF原代B淋巴细胞专用培养基
DELF原代精原细胞专用培养基
DELF原代树突状（DC）细胞专用培养基
DELF原代肝卵圆细胞专用培养基
DELF原代肾足细胞专用培养基
DELF原代基底细胞专用培养基
DELF原代基质细胞专用培养基
DELF原代CIK细胞专用培养基
DELF原代淋巴细胞专用培养基
DELF原代肌腱细胞专用培养基
DELF原代卵泡膜细胞专用培养基
DELF原代支持细胞专用培养基
DELF原代髓核细胞专用培养基
DELF原代脂肪细胞专用培养基
DELF原代绒毛膜滋养层细胞专用培养基
请注意：
所有500ml专用培养基采用分装形式发货，其中细胞因子，双抗，血清采用干冰发货，基础培养基采用冰袋发货。收到货后根据业务经理提示的配置方式进行配置，各成分按照存储温度分开存储。
1）细胞冻存复苏操作
取装有1 mL 细胞悬液的冻存管，置于 37 ℃水浴中快速振荡至完全解冻；将细胞悬液移入装有 4~6 mL 完全培养基的离心管，充分混匀。 1000 RPM 离心 3~5 min，弃除上清，加入新鲜完全培养基重悬细胞。把细胞悬液接种至培养瓶（培养皿），补加 6~8 mL 完全培养基，于 37 ℃恒温培养箱静置培养过夜。次日在显微镜下观察细胞状态与汇合密度。
2）细胞传代培养
当细胞汇合度达到 80%~90% 时即可进行传代操作。 本细胞贴壁性能弱，属于半贴壁 + 半悬浮混合生长型细胞，传代操作步骤如下：
1. 细胞收集 先把培养瓶内悬浮细胞全部转移至离心管；采用无钙镁 PBS 洗涤贴壁细胞 1~2 次。该细胞贴壁不牢固，洗涤过程中贴壁细胞会随 PBS 脱落，因此洗涤液同样收集至离心管内。
2. 胰酶消化 向培养瓶内加入 0.25%(w/v) 胰蛋白酶 - 0.53 mM EDTA 消化液（T25 培养瓶加 1~2 mL，T75 培养瓶加 2~3 mL），放入 37 ℃培养箱消化 1~2 min；若细胞较难消化，可适度延长消化时长。显微镜下观察，待绝大多数细胞回缩变圆、开始脱壁后迅速取出培养瓶，轻敲瓶壁，随即加入 3~4 mL 含 10% 胎牛血清的培养基终止胰酶消化。
3. 离心分瓶接种 将悬浮细胞、PBS 洗涤细胞与胰酶消化收获的所有细胞合并，1000 rpm 离心 5 min，弃上清。加入 1~2 mL 新鲜培养基充分重悬，按照 1:2 的比例分装至新 T25 培养瓶，每瓶补加 6~8 mL 新鲜配制的完全培养基，维持细胞活性。后续传代可依据细胞生长速率，调整分装比例为 1:2 ~ 1:5。
3）细胞冻存保种
建议在细胞到货后的前 3 代完成种子细胞冻存，留存保种库，保障后续实验供给。 以 T25 培养瓶为例，操作流程如下：
1.参照细胞传代流程完成细胞消化与收集，使用血球计数板测定活细胞浓度。推荐冻存终密度：(1×106 至1×107) 个活细胞 /mL。
2.1000 rpm 离心 3~5 min，充分弃除上清液；用预先配制好的冻存液重悬细胞，调整浓度至目标密度，分装至细胞冻存管。在冻存管外壁清晰标注细胞名称、细胞代数、冻存日期等关键信息。
3.将冻存管放入程序降温盒，置于 - 80 ℃冰箱梯度降温过夜；次日转移至液氮罐中长期保存，同步登记冻存位置编号，方便后续调取。
悬浮细胞传代方法
1.当细胞密度达到8-10×105cell/ml 时，进行传代处理。
2.在生物安全柜无菌环境下打开培养瓶，将瓶内全部细胞悬液移入离心管。
3.1000 rpm 离心 5 min，离心结束后弃除上清培养液。
4.准备 2 支全新 T-25 培养瓶。向细胞沉淀中加入完全培养基充分重悬，把细胞浓度调整至 2-4×105cell/ml，均分接种至两个培养瓶内，每瓶补加培养基至 6～8 mL。
5.水平平放培养瓶，轻轻摇匀细胞悬液，放入 37 ℃、5% CO?恒温培养箱静置培养。
仅用于科研，不用于临床
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