别称HLEC;Human Lymphatic Endothelial Cells货号Delf-16791 规格 5×10⁵/T25培养瓶

Cell Specification

The lymphatic system is an essential part of the immune system. It helps maintain tissue homeostasis, including interstitial protein transport, tissue fluid balance, and development of cellular immunity. Lymph  nodes,  which  are  located  throughout  the  lymphatic  system,  contain  large  numbers  of lymphocytes, macrophages and antigen presenting cells that together initiate primary immune response [1]. Specialized lymphatic endothelial cells (LEC) in the cortex assist in the primary immune response by recruiting intravascular lymphocytes as they circulate past [2].  In addition, LEC are responsible for facilitating the transmigration of intravascular lymphocytes into the reticular meshwork where the lymphocytes can interact with antigen presenting cells [2]. LEC have been shown to be associated with chronic inflammation and cancers [3].

HLEC  from  ScienCell  Research  Laboratories  are  isolated  from  human  lymph  node.  HLEC  are cryopreserved at passage one and delivered frozen. Each vial contains >5 x 10^5  cells in 1 ml volume. HLEC are characterized by immunofluorescence with antibodies specific to vWF/Factor VIII and/or CD31 (PECAM1). HLEC are negative for HIV- 1, HBV, HCV, mycoplasma, bacteria, yeast, and fungi. HLEC are guaranteed to further expand for 10 population doublings under the conditions provided by ScienCell Research Laboratories.

Recommended Medium

It is recommended to use Endothelial Cell Medium (ECM, Cat. #1001) for culturing HLEC in vitro.

Product Use

HLEC are for research use only. They are not approved for human or animal use, or for application in in vitro diagnostic procedures.

Storage

Upon receiving, directly and immediately transfer the cells from dry ice to liquid nitrogen and keep the cells in liquid nitrogen until they are needed for experiments.

Shipping

Dry ice.

References

[1] Kaldjian EP, Gretz JE, Anderson AO, Shi Y, Shaw S . (2001) “Spatial and molecular organization of lymph node T cell cortex: a labyrinthine cavity bounded by an epithelium-like monolayer of fibroblastic reticular cells anchored to basement membrane-like extracellular matrix. " Int Immunol. 13: 1243-53.

[2] Willard-Mack CL. (2006) “Normal structure, function, and histology of lymph nodes." Toxicol Pathol. 34: 409-24.

[3] Martinet L, Garrido I, Filleron T, Le Guellec S, Bellard E, Fournie JJ, Rochaix P, Girard JP.  (2011) “Human solid tumors contain high endothelial venules: association with T- and B-lymphocyte infiltration and favorable prognosis in breast cancer." Cancer Res. 71: 5678-87.

Instructions for culturing primary cells                                                   

Caution:Cryopreserved primary cells are very delicate. Thaw the vial in a 37oC water bath and return the cells to culture as quickly as possible with minimal handling! Do not centrifuge the cells after thawing as this can damage the cells.

Initiating the culture:

Note: ScienCell primary cells must be cultured in a 37oC, 5% CO2 incubator. Cells are only warranted if ScienCell media and reagents are used and the recommended protocols are followed.

1.   Prepare a fibronectin-coated culture vessel (2 μg/cm2, T-75 flask is recommended). To obtain a 2 μg/cm2 fibronectin-coated culture vessel, add 10 ml of sterile Dulbecco’s phosphate buffered saline, Ca++- and Mg++-free (Cat. #0303) to a T-75 flask and then add 150 μl of fibronectin stock solution (Cat. #8248). Leave vessel in a 37oC incubator overnight (or for at least 2 hours).

2.   Prepare complete medium. Decontaminate the external surfaces of medium bottle and medium supplement tubes with 70% ethanol and transfer them to a sterile field. Aseptically transfer supplement to the basal medium with a pipette. Rinse the supplement tube with medium to recover the entire volume.

3.   Aspirate the fibronectin solution and add 20 ml of complete medium to the culture vessel. The fibronectin solution can be reused twice. Leave the vessel in the sterile field and proceed to thaw the cryopreserved cells.

4.   Place the frozen vial in a 37oC water bath. Hold and rotate the vial gently until the contents completely thaw. Promptly remove the vial  from the water bath, wipe it  down with  70% ethanol, and transfer it to the sterile field.

5.   Carefully remove the cap without touching the interior threads. Gently resuspend and dispense the contents of the vial into the equilibrated, fibronectin-coated culture vessel.

Note: Dilution  and centrifugation  of  cells  after thawing are not recommended as  these actions are more harmful to the cells than the effect of residual DMSO in the culture. It is also important that cells are plated in fibronectin-coated culture vessels to promote cell attachment.

6.   Replace the cap or lid of the culture vessel and gently rock the vessel to distribute the cells evenly. Loosen cap, if necessary, to allow gas exchange.

7.   Return the culture vessel to the incubator.

8.   Do not disturb the culture for at least  16 hours after the culture has been initiated. Refresh culture medium the next day to remove residual DMSO and unattached cells.

Maintaining the culture:

1.   Refresh  supplemented  culture  medium  the  next  morning  after  establishing  a  culture  from cryopreserved cells.

2.   Change  the  medium  every  three  days  thereafter,  until  the  culture  is  approximately  70% confluent.

3.   Once the culture reaches 70% confluency, change medium every other day until the culture is approximately 90% confluent.

Subculturing:

1.   Subculture when the culture reaches 90% confluency.

2.   Prepare fibronectin-coated culture vessels (2 μg/cm2) one day before subculture.

3.   Warm complete medium, trypsin/EDTA solution, 0.05% (T/E, Cat. #0183), T/E neutralization solution  (TNS,  Cat.  #0113),  and  DPBS  (Ca++-  and  Mg++-free,  Cat.  #0303)  to  room temperature. We do not recommend warming reagents and medium in a 37oC water bath prior to use.

4.   Rinse the cells with DPBS.

5.   Add 8 ml DPBS and 2 ml 0.05% T/E solution (Cat. #0183) into flask (in the case of a T-75 flask). Gently rock the  flask to ensure complete coverage of cells by T/E  solution. Use a microscope to monitor the change in cell morphology.

Note: We recommend using ScienCell’s 0.05% T/E solution, which is optimized to minimize cell damage due to over trypsinization. If 0.25% T/E solution (Cat. #0103) is used, then 9.6 ml of DPBS and 0.4 ml of 0.25% T/E solution should be used.

Caution: Do NOT use undiluted trypsin when subculturing primary cells.

6.   During incubation, prepare a 50 ml conical centrifuge tube with 5 ml of fetal bovine serum (FBS, Cat. #0500).

7.   Once the cells completely round up, transfer T/E solution from the flask to a 50 ml centrifuge tube (a small percent of cells may detach) and continue to incubate the flask at 37oC for another minute (no solution in the flask at this time).

8.   At the end of incubation, gently tap the side of the flask to dislodge cells from the surface. Check under a microscope to make sure that all cells detach.

9.   Add 5 ml of TNS solution to the flask and transfer detached cells to the 50 ml centrifuge tube. Rinse the flask with another 5 ml of TNS to collect the residual cells.

10. Examine the flask under a microscope for a successful cell harvest by looking at the number of cells being left behind; there should be less than 5%.

11. Centrifuge the 50 ml centrifuge tube at  1000 rpm for 5 minutes. Gently resuspend cells in culture medium.

12. Count and plate cells in a new fibronectin-coated culture vessel with the recommended cell density. A seeding density of 5,000-7,000 cells/cm2 is recommended.

Note: We do not recommend cryopreservation of primary cells by the end user. Refreezing cells may damage them and affect cell performance. ScienCell does not guarantee primary cells cryopreserved by the end user.

Caution: Handling human derived products is potentially biohazardous. Although each cell strain tests negative for HIV, HBV and HCV DNA, diagnostic tests are not necessarily 99% accurate, therefore, proper precautions must be taken to avoid inadvertent exposure. Always wear gloves and safety glasses when working with these materials. Never mouth pipette.  We  recommend following  the  universal procedures for handling products  of  human  origin  as  the minimum precaution against contamination [1].

[1] Grizzle WE, Polt S. (1988) “Guidelines to avoid personal contamination by infective agents in research laboratories that use human tissues." J Tissue Cult Methods. 11: 191 ‐9

我们主要的产品有：病理学检测服务，细胞与蛋白，分子生物学检测，动物实验造模，科研细胞及相关周边配套产品与服务。

细胞产品：包含细胞系、原代细胞、永生化细胞（支持定制），Luc示踪细胞、IPS细胞、耐药株、细胞代购服务。

病理服务：包含普通病理（包埋，切片，染色）、分子病理（组化、免疫荧光、TUNEL、原味杂交）、病理图像（切片扫描、单标多标、共聚焦、三维重建）、超微病理（透射电镜、扫描电镜、免疫电镜服务）。

培养基产品：包含基础培养基如DMEM、DMEM/F12、1640、MEM、EMEM、F12、F12K、L15、DMEM低碳、1640低碳，无酚红定制产品等基础培养基供应。

细胞系专用培养基：涵盖我库所有细胞系对应的专用培养基（含血清，因子，双抗等），价格实惠。

原代细胞专用培养基包括：

DELF原代上皮细胞专用培养基（EpiCM）

DELF原代成纤维细胞专用培养基（FM）

DELF原代内皮细胞专用培养基（ECM）

IPS人诱导多能干细胞专用培养基

DELF原代神经元细胞专用培养基

DELF原代少突胶质细胞专用培养基

DELF原代星形胶质细胞专用培养基

DELF原代肝实质细胞专用培养基

DELF原代星状细胞专用培养基

DELF原代角质形成细胞专用培养基

DELF原代巨噬细胞专用培养基

DELF原代间充质干细胞专用培养基

DELF原代内皮祖细胞专用培养基

DELF原代神经干细胞专用培养基

DELF原代周细胞专用培养基

DELF原代雪旺细胞专用培养基

DELF原代黑色素细胞专用培养基

DELF原代骨骼肌细胞专用培养基

DELF原代成骨细胞专用培养基

DELF原代软骨细胞专用培养基

DELF原代肾系膜细胞专用培养基

DELF原代心肌细胞专用培养基

DELF原代前脂肪细胞专用培养基

DELF原代间充质干细胞无血清专用培养基

DELF原代平滑肌细胞专用培养基

DELF原代平滑肌细胞低血清专用培养基

DELF原代肿瘤细胞专用培养基

DELF原代间质细胞专用培养基

DELF原代T淋巴细胞专用培养基

DELF原代卵巢颗粒细胞专用培养基

DELF原代肥大细胞专用培养基

DELF原代破骨细胞专用培养基

DELF原代NK细胞专用培养基

DELF原代内膜细胞专用培养基

DELF原代B淋巴细胞专用培养基

DELF原代精原细胞专用培养基

DELF原代树突状（DC）细胞专用培养基

DELF原代肝卵圆细胞专用培养基

DELF原代肾足细胞专用培养基

DELF原代基底细胞专用培养基

DELF原代基质细胞专用培养基

DELF原代CIK细胞专用培养基

DELF原代淋巴细胞专用培养基

DELF原代肌腱细胞专用培养基

DELF原代卵泡膜细胞专用培养基

DELF原代支持细胞专用培养基

DELF原代髓核细胞专用培养基

DELF原代脂肪细胞专用培养基

DELF原代绒毛膜滋养层细胞专用培养基

请注意：

所有500ml专用培养基采用分装形式发货，其中细胞因子，双抗，血清采用干冰发货，基础培养基采用冰袋发货。收到货后根据业务经理提示的配置方式进行配置，各成分按照存储温度分开存储。

1）细胞冻存复苏操作

取装有1 mL 细胞悬液的冻存管，置于 37 ℃水浴中快速振荡至完全解冻；将细胞悬液移入装有 4~6 mL 完全培养基的离心管，充分混匀。 1000 RPM 离心 3~5 min，弃除上清，加入新鲜完全培养基重悬细胞。把细胞悬液接种至培养瓶（培养皿），补加 6~8 mL 完全培养基，于 37 ℃恒温培养箱静置培养过夜。次日在显微镜下观察细胞状态与汇合密度。

2）细胞传代培养

当细胞汇合度达到 80%~90% 时即可进行传代操作。 本细胞贴壁性能弱，属于半贴壁 + 半悬浮混合生长型细胞，传代操作步骤如下：

1. 细胞收集 先把培养瓶内悬浮细胞全部转移至离心管；采用无钙镁 PBS 洗涤贴壁细胞 1~2 次。该细胞贴壁不牢固，洗涤过程中贴壁细胞会随 PBS 脱落，因此洗涤液同样收集至离心管内。

2. 胰酶消化 向培养瓶内加入 0.25%(w/v) 胰蛋白酶 - 0.53 mM EDTA 消化液（T25 培养瓶加 1~2 mL，T75 培养瓶加 2~3 mL），放入 37 ℃培养箱消化 1~2 min；若细胞较难消化，可适度延长消化时长。显微镜下观察，待绝大多数细胞回缩变圆、开始脱壁后迅速取出培养瓶，轻敲瓶壁，随即加入 3~4 mL 含 10% 胎牛血清的培养基终止胰酶消化。

3. 离心分瓶接种 将悬浮细胞、PBS 洗涤细胞与胰酶消化收获的所有细胞合并，1000 rpm 离心 5 min，弃上清。加入 1~2 mL 新鲜培养基充分重悬，按照 1:2 的比例分装至新 T25 培养瓶，每瓶补加 6~8 mL 新鲜配制的完全培养基，维持细胞活性。后续传代可依据细胞生长速率，调整分装比例为 1:2 ~ 1:5。

3）细胞冻存保种

建议在细胞到货后的前 3 代完成种子细胞冻存，留存保种库，保障后续实验供给。 以 T25 培养瓶为例，操作流程如下：

1.参照细胞传代流程完成细胞消化与收集，使用血球计数板测定活细胞浓度。推荐冻存终密度：(1×106 至1×107) 个活细胞 /mL。

2.1000 rpm 离心 3~5 min，充分弃除上清液；用预先配制好的冻存液重悬细胞，调整浓度至目标密度，分装至细胞冻存管。在冻存管外壁清晰标注细胞名称、细胞代数、冻存日期等关键信息。

3.将冻存管放入程序降温盒，置于 - 80 ℃冰箱梯度降温过夜；次日转移至液氮罐中长期保存，同步登记冻存位置编号，方便后续调取。

悬浮细胞传代方法

1.当细胞密度达到8-10×105cell/ml 时，进行传代处理。

2.在生物安全柜无菌环境下打开培养瓶，将瓶内全部细胞悬液移入离心管。

3.1000 rpm 离心 5 min，离心结束后弃除上清培养液。

4.准备 2 支全新 T-25 培养瓶。向细胞沉淀中加入完全培养基充分重悬，把细胞浓度调整至 2-4×105cell/ml，均分接种至两个培养瓶内，每瓶补加培养基至 6～8 mL。

5.水平平放培养瓶，轻轻摇匀细胞悬液，放入 37 ℃、5% CO?恒温培养箱静置培养。

仅用于科研，不用于临床