货号Delf-17770 规格 1×10⁶/T25培养瓶 传代比例1:2传代用途仅供科研使用

【产品名称】

中文名称：人外周血 CD4+T 细胞

英文名称：Human Peripheral Blood CD4+ T Cells

【预期用途】

可作为多种领域研究所需的原材料。

【贮藏条件与有效期】

置于液氮保存，有效期为 24 个月；

生产日期，有效期至：见标签。

【产品简介】

CD4 分子系细胞表面糖蛋白，MHC Ⅱ类限制性抗原诱导 T 细胞活化的共受体。正常表达见于在皮质胸腺细胞表面与 CD8 同时表达，而在大部分末期胸腺细胞和成熟 T 细胞只表达 CD4而不表达 CD8。幼稚髓系细胞、嗜酸粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和郎罕氏细胞均可表达 CD4。

异常表达见于急性 T 淋巴细胞白血病的原始细胞、成熟 T 细胞淋巴瘤的肿瘤细胞，有时也可表达于急性髓细胞白血病的原始细胞，尤其是 M4 或 M5，亦可表达于郎罕氏组织细胞增多症。三一造血利用自有的 Flosep-C 细胞分离纯化技术从外周血中纯化出 CD4 +辅助 T 细胞，经流式检测，其纯度大于 85%，纯化后置于液氮保存。

【操作步骤】

所需试剂：

(1)IMDM，α-MEM 或 RPMI-1640      (2) FBS     (3) DNase I

操作流程：

1 准备好 37°C 水浴，将 RPMI-1640 与 FBS 温浴至 37°C；

2 生物安全柜中，配制含 10% FBS 的培养基（IMDM, α-MEM 或 RPMI-1640 均可），待用；

3 从液氮中取出 CD3+CD4+T 细胞冻存管，置于-80°C 超低温冰箱中数分钟，使冻存管中的液氮挥发，而后迅速将其置于 37°C 温水中，并快速水平晃动，使其内含物尽快融化，直至冻存管固体内含物余下一小冰屑后取出冻存管；

注意：

1）从液氮中取出冻存管时，往往在冻存管里含有液氮，先将冻存管先置于超低温冰箱中， 使液氮挥发，再进行水浴化冻的操作；

2）尽可能将冻存管的内含物全部浸没于 37°C 温水中，使内含物均匀融化；

3) 请勿使温水没过冻存管盖的螺口，以防污染；

4) 细胞复苏的操作过程要迅速，避免影响细胞复苏后的活性。

5) 采用正选（Positive selection）方法分离的细胞因细胞表面标记有磁珠，故可能冻存管中细胞颜色较深，此为正常现象，不影响后续复苏和使用。

4 在将冻存管拿进生物安全柜之前，用 75%酒精对其表面进行消毒；

5 轻轻重悬细胞，并将其移入装有 100μg DNase I 的 50mL 离心管里；

注意：

1）加入 DNase I 可有效减少细胞复苏后细胞团块的产生；

2）DNase I 的使用是非必须的，对于 DNA, RNA 等的提取目的可不使用。

6 用 1mL 培养基冲洗冻存管，并将此悬液以 3-5s 每滴的速度滴加到 50mL 离心管中，并且同时轻轻摇晃离心管，使滴加的悬液混匀；

7 吸取 15-20mL 的培养基以 3-5s 每滴的速度滴加到 50mL 离心管中，并且同时轻轻摇晃离心管，使滴加的悬液混匀；

注意：第 5,6,7 步骤可使细胞中的 DMSO 缓慢均匀的渗透出来，保证细胞安全，但操作较为缓慢，若有多个样品需要处理时，可以将操作步骤更改为：

5’：轻轻重悬细胞，并将其移入装有 100μg DNase I 的 15mL 离心管里；

6’：用 1mL 培养基冲洗冻存管，并将此悬液合并到到 15mL 离心管里；

7’：吸取 10mL 培养基，直接加入到 15mL 离心管中，反复轻柔吹打或上下颠倒混匀，室温孵育 10min；

8 室温下，300g 离心 10min；

9 迅速使用移液枪吸走上清，剩余少许液体，并轻轻吹打液体使细胞悬浮；

注意：

1）离心结束后，尽快吸走上清；

2) 吹打液体时动作要轻，避免损伤细胞，并且吹打时尽可能避免气泡产生。

10 缓慢加入 15-20mL 新鲜培养基（快速法中则只要在 15mL 离心管中加入 10mL 培养基即可）， 并同时轻轻摇晃离心管；

11 室温下，300g 离心 10min；

注意：采用正选（Positive selection）方法分离的细胞因细胞表面标记有磁珠，故离心后管中细胞沉淀颜色较深，此为正常现象，不影响后续使用。

12 迅速使用移液枪吸走上清，剩余少许液体，并轻轻吹打液体使细胞悬浮，此 CD3+CD4+T 细胞即可用于下游实验。

【产品性能指标】

产品性能符合本企业制定的产品技术要求。

【重要说明】

1 本项服务所需细胞材料必须符合国家遗传资源相关法律规定。如有需要，三一造血可协助使用方取得伦理批件及申请人类遗传资源行政许可；

2 细胞分离服务所得细胞用于科学研究使用，不得用于临床诊断及临床治疗，否则由此引起一切后果由使用方承担。 

我们主要的产品有：病理学检测服务，细胞与蛋白，分子生物学检测，动物实验造模，科研细胞及相关周边配套产品与服务。

细胞产品：包含细胞系、原代细胞、永生化细胞（支持定制），Luc示踪细胞、IPS细胞、耐药株、细胞代购服务。

病理服务：包含普通病理（包埋，切片，染色）、分子病理（组化、免疫荧光、TUNEL、原味杂交）、病理图像（切片扫描、单标多标、共聚焦、三维重建）、超微病理（透射电镜、扫描电镜、免疫电镜服务）。

培养基产品：包含基础培养基如DMEM、DMEM/F12、1640、MEM、EMEM、F12、F12K、L15、DMEM低碳、1640低碳，无酚红定制产品等基础培养基供应。

细胞系专用培养基：涵盖我库所有细胞系对应的专用培养基（含血清，因子，双抗等），价格实惠。

原代细胞专用培养基包括：

DELF原代上皮细胞专用培养基（EpiCM）

DELF原代成纤维细胞专用培养基（FM）

DELF原代内皮细胞专用培养基（ECM）

IPS人诱导多能干细胞专用培养基

DELF原代神经元细胞专用培养基

DELF原代少突胶质细胞专用培养基

DELF原代星形胶质细胞专用培养基

DELF原代肝实质细胞专用培养基

DELF原代星状细胞专用培养基

DELF原代角质形成细胞专用培养基

DELF原代巨噬细胞专用培养基

DELF原代间充质干细胞专用培养基

DELF原代内皮祖细胞专用培养基

DELF原代神经干细胞专用培养基

DELF原代周细胞专用培养基

DELF原代雪旺细胞专用培养基

DELF原代黑色素细胞专用培养基

DELF原代骨骼肌细胞专用培养基

DELF原代成骨细胞专用培养基

DELF原代软骨细胞专用培养基

DELF原代肾系膜细胞专用培养基

DELF原代心肌细胞专用培养基

DELF原代前脂肪细胞专用培养基

DELF原代间充质干细胞无血清专用培养基

DELF原代平滑肌细胞专用培养基

DELF原代平滑肌细胞低血清专用培养基

DELF原代肿瘤细胞专用培养基

DELF原代间质细胞专用培养基

DELF原代T淋巴细胞专用培养基

DELF原代卵巢颗粒细胞专用培养基

DELF原代肥大细胞专用培养基

DELF原代破骨细胞专用培养基

DELF原代NK细胞专用培养基

DELF原代内膜细胞专用培养基

DELF原代B淋巴细胞专用培养基

DELF原代精原细胞专用培养基

DELF原代树突状（DC）细胞专用培养基

DELF原代肝卵圆细胞专用培养基

DELF原代肾足细胞专用培养基

DELF原代基底细胞专用培养基

DELF原代基质细胞专用培养基

DELF原代CIK细胞专用培养基

DELF原代淋巴细胞专用培养基

DELF原代肌腱细胞专用培养基

DELF原代卵泡膜细胞专用培养基

DELF原代支持细胞专用培养基

DELF原代髓核细胞专用培养基

DELF原代脂肪细胞专用培养基

DELF原代绒毛膜滋养层细胞专用培养基

请注意：

所有500ml专用培养基采用分装形式发货，其中细胞因子，双抗，血清采用干冰发货，基础培养基采用冰袋发货。收到货后根据业务经理提示的配置方式进行配置，各成分按照存储温度分开存储。

1）细胞冻存复苏操作

取装有1 mL 细胞悬液的冻存管，置于 37 ℃水浴中快速振荡至完全解冻；将细胞悬液移入装有 4~6 mL 完全培养基的离心管，充分混匀。 1000 RPM 离心 3~5 min，弃除上清，加入新鲜完全培养基重悬细胞。把细胞悬液接种至培养瓶（培养皿），补加 6~8 mL 完全培养基，于 37 ℃恒温培养箱静置培养过夜。次日在显微镜下观察细胞状态与汇合密度。

2）细胞传代培养

当细胞汇合度达到 80%~90% 时即可进行传代操作。 本细胞贴壁性能弱，属于半贴壁 + 半悬浮混合生长型细胞，传代操作步骤如下：

1. 细胞收集 先把培养瓶内悬浮细胞全部转移至离心管；采用无钙镁 PBS 洗涤贴壁细胞 1~2 次。该细胞贴壁不牢固，洗涤过程中贴壁细胞会随 PBS 脱落，因此洗涤液同样收集至离心管内。

2. 胰酶消化 向培养瓶内加入 0.25%(w/v) 胰蛋白酶 - 0.53 mM EDTA 消化液（T25 培养瓶加 1~2 mL，T75 培养瓶加 2~3 mL），放入 37 ℃培养箱消化 1~2 min；若细胞较难消化，可适度延长消化时长。显微镜下观察，待绝大多数细胞回缩变圆、开始脱壁后迅速取出培养瓶，轻敲瓶壁，随即加入 3~4 mL 含 10% 胎牛血清的培养基终止胰酶消化。

3. 离心分瓶接种 将悬浮细胞、PBS 洗涤细胞与胰酶消化收获的所有细胞合并，1000 rpm 离心 5 min，弃上清。加入 1~2 mL 新鲜培养基充分重悬，按照 1:2 的比例分装至新 T25 培养瓶，每瓶补加 6~8 mL 新鲜配制的完全培养基，维持细胞活性。后续传代可依据细胞生长速率，调整分装比例为 1:2 ~ 1:5。

3）细胞冻存保种

建议在细胞到货后的前 3 代完成种子细胞冻存，留存保种库，保障后续实验供给。 以 T25 培养瓶为例，操作流程如下：

1.参照细胞传代流程完成细胞消化与收集，使用血球计数板测定活细胞浓度。推荐冻存终密度：(1×106 至1×107) 个活细胞 /mL。

2.1000 rpm 离心 3~5 min，充分弃除上清液；用预先配制好的冻存液重悬细胞，调整浓度至目标密度，分装至细胞冻存管。在冻存管外壁清晰标注细胞名称、细胞代数、冻存日期等关键信息。

3.将冻存管放入程序降温盒，置于 - 80 ℃冰箱梯度降温过夜；次日转移至液氮罐中长期保存，同步登记冻存位置编号，方便后续调取。

悬浮细胞传代方法

1.当细胞密度达到8-10×105cell/ml 时，进行传代处理。

2.在生物安全柜无菌环境下打开培养瓶，将瓶内全部细胞悬液移入离心管。

3.1000 rpm 离心 5 min，离心结束后弃除上清培养液。

4.准备 2 支全新 T-25 培养瓶。向细胞沉淀中加入完全培养基充分重悬，把细胞浓度调整至 2-4×105cell/ml，均分接种至两个培养瓶内，每瓶补加培养基至 6～8 mL。

5.水平平放培养瓶，轻轻摇匀细胞悬液，放入 37 ℃、5% CO?恒温培养箱静置培养。

仅用于科研，不用于临床